基準醫療多癌種早篩系列報道-結直腸癌篇

基準醫療(AnchorDx)與中山大學附屬第六醫院的蘭平教授和吳現瑞教授團隊在Molecular Oncology(影響因子: 6.574)發表了一篇題為“A novel cell-free DNA methylation-based model improves the early detection of colorectal cancer”的研究論文。

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結直腸癌(CRC)是全球第三大最常見的惡性腫瘤，盡管治療方法有所改善，但TNM晚期CRC患者的預后仍較差。I期CRC患者的5年生存率為91%，而IV期僅為14%。因此，對早期CRC的精準篩查是降低CRC相關死亡率的關鍵策略之一。

目前，CRC篩查方法主要分為有創結腸鏡檢查和無創大便CRC篩查，有創結腸鏡檢查存在對技術和設備要求高、檢查前需要徹底清潔腸道、侵入性檢查會帶來一定的痛苦和并發癥風險、患者依從性差等問題;而無創大便CRC篩查存在假陽性率高、非必要的治療、價格相對較高、缺乏長期隨訪研究數據等問題，現階段迫切需要一種高靈敏度和特異度的無創性CRC篩查產品。

本項目研究通過187個組織DNA樣本(91個非惡性組織，26個進展期腺瘤[AA]和70個CRC)和489個血漿cfDNA樣本進行靶向DNA甲基化測序，建立并驗證了用于AA和早期CRC非侵入性檢測的基于11個DNA甲基化生物標志物的cfDNA甲基化模型。

1 、研究工作流程

為鑒定結直腸癌(CRC)特異的DNA甲基化生物標志物，研究者收集了313個組織樣本(139例正常，30例進展期腺瘤[AA]和144例結直腸癌[CRC])進行靶向DNA甲基化二代測序(NGS)。此外，為進一步探索這些DNA甲基化標志物在CRC早期檢測中的臨床應用，采集了577例血漿樣本(169例健康對照組、44例非進展期腺瘤[NAA]、76例AA和288例CRC)進行NGS測序分析。經過DNA提取、文庫構建和DNA甲基化測序的質控，最終分析了187個組織樣本和489個血漿樣本。應用Wilcoxon檢驗和Benjamini-Hochberg多重檢驗篩選組織隊列，得到了667個CRC特異的DNA甲基化生物標志物。將133例正常血漿樣本和248例CRC血漿樣本隨機分組到訓練和驗證集中，進行建模分析，從該667個生物標志物中進一步篩選CRC特異甲基化生物標志物。在LASSO選擇后，基于訓練集獲得11個CRC特異性甲基化生物標志物，然后使用驗證集進一步確認。最終，通過對NAA、AA和CRC患者的診斷來評估該模型的臨床價值。同時，通過與癌胚抗原(CEA)和碳水化合物抗原19-9(CA19-9)方法的比較，評估了該模型在CRC管理中的穩定性。(Figure 1)

Figure 1. The study workflow chart.

2、健康對照組、NAA、AA和CRC患者的cfDNA提取分析

比較551例(162例健康對照[正常]、44例非進展期腺瘤[NAA]、74例進展期腺瘤[AA]、69例結直腸癌I期[I]、97例結直腸癌II期[II]、70例結直腸癌III期[III]、35例結直腸癌IV期[IV])cfDNA質控合格的樣本的cfDNA濃度。數據顯示為平均值±標準差(SD);ns，不顯著(Figure 2，***p<0.001;****p<0.0001)。

Figure 2. The cfDNA extraction analysis in healthy controls, NAA, AA, and CRC patients.

3、組織DNA甲基化圖譜的表征

187個組織樣本中667個結直腸癌(CRC)特異DNA甲基化生物標志物的無監督分層聚類分析(Figure 3A)。CRC、進展期腺瘤(AA)和正常樣本的主成分分析(Figure 3B)。CRC與AA組甲基化模式的相關性分析(Figure 3C)。基于9921個生物標志物計算平均甲基化水平。圖中的值是與正常樣本共甲基化值(PCM)的比值，然后進行Log2轉換來生成的。

Figure 3. Characterization of the tissue DNA methylation landscape.

4、cfDNA甲基化模型檢測腺瘤和CRC患者的性能和風險評分

在訓練和驗證集中，模型的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.90(0.85-0.94)和0.92(0.88-0.96)(Figure 4A-B)。應用于腺瘤患者的診斷時，該模型在腺瘤、非進展期腺瘤(NAA)和進展期腺瘤(AA)中分別達到0.82(0.76-0.87)、0.77(0.69-0.86)和0.85(0.78-0.91)(Figure 4C-E)。該模型在I期結直腸癌檢測中的AUC為0.90(0.86-0.95)(n=199)(Figure 4F)。該模型在結直腸癌(CRC)患者的診斷中表現突出，AUC為0.91(0.88-0.94)(n=381)(Figure 4G)。在CRC和AA隊列(n=449)的檢測中，模型的總體AUC為0.90(0.87-0.93)(Figure 4H)。模型在健康對照(正常)和NAA、AA以及結直腸癌I-IV期患者中的風險評分(n=489，配對t檢驗;Figure 4I，*****p<0.0001)。

Figure 4. The performance and risk score of the cell-free DNA methylation model in detecting adenoma and CRC patients.

5 、 cfDNA 甲基化模型與腫瘤生物標志物 CEA 和 CA19-9 的 CRC 診斷性能比較

cfDNA甲基化模型、癌胚抗原(CEA)和碳水化合物抗原19-9(CA19-9)檢測結直腸癌(CRC)的ROC曲線下面積分別為0.91(0.88-0.94)、0.77(0.72-0.82)和0.59(0.53-0.65;Figure 5)。

Figure 5. Comparison of CRC diagnostic performance between the cfDNA methylation model and the tumor biomarker CEA and CA19-9.

本研究建立并驗證了用于 AA 和早期 CRC 非侵入性檢測的基于 11 個 DNA 甲基化生物標志物的 cfDNA 甲基化模型。我們收集了來自 CRC 、進展期腺瘤 （AA） 、非進展期腺瘤和健康對照組的 313 個組織和 577 個血漿樣本，去除質控不合格的，選擇 187 個組織 DNA 樣本（來自 CRC 患者的 91 個非惡性組織， 26 個 AA 和 70 個 CRC ）和 489 個血漿 cfDNA 樣本進行靶向 DNA 甲基化測序。在訓練隊列中基于 11 個甲基化生物標志物（ ROC 曲線下面積 [AUC]=0.90[0.85-0.94] ）開發了一個用于 CRC 檢測的 cfDNA 甲基化模型，該模型在驗證隊列（ AUC=0.92[0.88-0.96] ）中得到驗證。本研究建立的 cfDNA 甲基化模型能夠穩定地診斷出早期 CRC（AUC=0.90[0.86-0.95]） 或 AA（AUC=0.85[0.78-0.91]） 的患者。該模型將在 CRC 的早期診斷臨床實踐中發揮著積極作用。

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